Rezultate Etapa I/2012

 

Rezumatul etapei

În această etapă au fost caracterizate morfologic telocitele, analizându-se comparativ lungimea telopodelor, în miometrul gravid şi negravid. Telocitele realizează reţele tridimensionale cu ajutorul telopodelor care intră în contact unele cu celelalte prin interacţiuni de tip homocelular. Numărul telopodelor pe unitatea de suprafaţă este de aprox. 20 pe 1000 µm2. A fost demonstrată prezenţa veziculelor extracelulare de tipul exosomilor sau “shedding vesicles”, ceea ce sugerează un posibil rol în semnalizarea intercelulară.

In vederea caracterizării biofizice s-a reuşit calibrarea pensetei optice. La nivelul telopodelor se observă o discretă modificare a lungimii in sensul creşterii si o modificare a conului de emergenţă a prelungirii.

S-a realizat caracterizarea electrofiziologică a telocitelor din miometrul uman. S-a evidenţiat absenţa unor caracteristici de excitabilitate asemănatoare cu neuronii, cum ar fi potentialul de acţiune sau prezenţa unor canale de sodiu voltaj-dependente. S-au evidenţiat curenţi spre interior (inward currents) prin canale voltaj-dependente şi canale de potasiu voltaj-dependente cu rectificare spre exterior, urmând a se face o caracterizare detaliată in etapa urmatoare a proiectului. Au fost făcute teste preliminare doar pe probe de miometru din biopsii de uter negravid.

 

REZULTATE

Rezultatele etapei actuale sunt corespunzătoare cu obiectivele propuse.

O1. Studiul ultrastructurii telocitelor miometriale (CO).

In urma studilor de microscopie electronică am reuşit evidenţierea pentru prima data a reţelei tridimensionale a telocitelor la nivelul uterului uman. Rezultatele studiului au fost publicate: Creţoiu SM, Creţoiu D, Popescu LM. Human myometrium - the ultrastructural 3D network of telocytes.J Cell Mol Med. 2012 Nov;16(11):2844-9. doi: 10.1111/j.1582-4934.2012.01651.x.

Telocitele au fost evidenţiate în miometrul uman negravid şi gravid prin microscopie electronică de transmisie, ca celule ale spaţiului interstiţial (fig. 5 şi 6). 

Fig. 5 Reconstructii bidimensionale ale telocitelor in uterul uman gravid.

 

Fig. 6 Reconstructii bidimensionale ale telocitelor in uterul uman negravid.

 

Aceste celule îndeplinesc toate criteriile necesare diagnosticului de telocite: au prelungiri lungi (până la 74 µm) şi foarte subţiri (50-200 nm) numite telopode. Telopodele se ramifică dihotomic şi au aspect moniliform datorită prezenţei podomerelor (porţiuni înguste) şi a podoamelor (regiuni dilatate). Numărul telopodelor a fost estimat la aproximativ 20 pe 1000 µm2 de spaţiu interstiţial. Tabelul 1 reliefează dimensiunile comparative ale lungimii telopodelor din figura 5 şi 6. Astfel, telopodele din uterul negravid au fost mai lungi şi mai subţiri decât cele din uterul gravid. Telopodele sunt interconectate între ele prin jonctiuni homocelulare şi formează o reţea 3D în spaţiul interstiţial din imediata vecinătate a fasciculelor de fibre musculare netede din miometru.De-a lungul telopodelor au fost observate pentru prima dată exosomi (vezicule cu diamtru între 60–100 nm) şi shedding vesicles (diametre de la 250–350 nm până la 1 µm).Eliberarea de exosomi sau de grupuri de shedding microvesicles sugerează ca telocitele uterine sunt echipate pentru a comunica prin intermediul telopodelor. De aceea ele ar putea facilita contactul la distanţă dintre diferite tipuri celulare.

 

O2. Videoînregistrarea comportamentului telocitelor în cultură(CO)

S-a reusit optimizarea tehnicii de recoltare a fragmentelor de tesut muscular din miometrul uman negravid si gravid si realizarea şi mentinerea culturilor celulare până la pasajul 11.Celulele au fost înregistrate prin  time lapse videomicroscopy şi vor servi drept martor pentru etapa III a proiectului care presupune studiul celulelor in medii suplimentate hormonal.

O3. Studiul biofizic al telopodelor. Determinarea proprietăţilor  membrane celulare cu ajutorul pensetei optice (P1)

 

Fig. 7. Populatia heterogena de celule.(ob.40x)

S-au efectuat teste preliminare de verificare a acţiunii pensetei optice (Dioda laser =810nm, putere 30mW, profil de intensitate Gaussian) pe aceste tipuri de celule interstiţiale (Fig 8). In momentul iniţial penseta optică a fost plasată la conul de emergenţă al unei prelungiri celulare de interes. Aceasta s-a mentinut un timp de 5 minute cu urmărirea modificărilor morfologice: forma, dimensiune, pozitie.  

 

Fig.8 Microscopie optică (ob. 40x, Zeiss, Axiovision). T:0 aplicarea pensetei optice asupra portiunii bazale a unei prelungiri. T:1 – 5 mentinerea pensetei optice timp de 1 – 5 minute. Se observa o discretă modificare a lungimi prelungirii in sensul cresterii si o modificare a conului de emergentă a prelungirii. 

Testele efectuate au presupus calibrarea pensetei optice necesare interacţiunii cu celulele intestiţiale. Aplicarea pensetei optice asupra prelungirilor celulare relevă o modificare certă a lungimii prelungirii cu o creştere a telopodelor. Imaginile secvenţiale arata modificari ale formei prelungirilor celulare ceea ce ne confirma ca penseta optica actioneaza eficient si este calibrata pentru studiile viitoare. Urmează să se efectueze teste de trapare şi cuantificarea cantitativă a forţelor de prindere raportate la diferite condiţii experimentale.

 

O4. Caracterizarea  electrofiziologică  a telocitelor in cultură (P2)

Prin protocoalele mai sus mentionate s-a incercat o caracterizare electrofiziologica a telocitelor. S-a incercat sa se determine: daca sunt celule excitabile sau inexcitabile, daca sunt prezenti curenti de sodiu voltaj-dependenti si curenti de potasiu de hiperpolarizare, daca sunt prezenti curenti de inward voltaj-dependenti.

In figura Fig 9A,B se observa un exemplu de celula considerata a indeplini caracteristicile morfologice de telocit descrise anterior in literatura: celule mononucleate mici cu cel putin un proces de tip prelungire mai lung de 50μm si mai subtire de 0.5 μm, si dilatatii moniliforme.

 

   

Figura 9A. Alegerea telocitului pe obiectivul 40x pentru realizarea unei inregistrari de patch-clamp. 

Figura 9B. Pipeta de patch-clamp in contact cu telocitul dupa inregistrare.

 

Se constată absenţa curenţilor de hiperpolarizare.

 

Fig 10A. Inregistrare prin protocolul de tip CP1.

De asemenea se poate observa blocarea eficienta a canalelor de potasiu BK (big conductance) prin aplicarea extracelulara a TEA (tetraetilamoniu). 

 

Fig 10B. Inregistrare prin protocolul de tip CP2.

 

Telocitele nu prezinta curenti de sodiu activati de voltaj.

 

Fig 10C. Inregistrare prin protocolul de tip CP3.

 

Conform datelor din literatura [41] am obtinut in telocite activarea unor curenti spre interior (inward currents) dependenti de voltaj cu o amplitudine de aproximativ 95-250 pA. 

 

 

Fig 10D. Inregistrare prin protocolul de tip CP4. Nu este prezent in aceasta inregistrare un curent de potasiu spre exterior (outward current)

 

 

Fig.10E. Inregistrare prin protocolul de tip CP4. Se constata prezenta accentuata a curentului de potasiu spre exterior.

Fitarea cu o singura exponentiala a indicat valori ale τinactiv de 0.99 ms.

 

 

Fig.10F Fitarea constantei de timp de inactivare pentru un curent de inward voltaj-dependent.

Pulsurile de voltaj peste -30 mV generaza curenti de potasiu spre exterior cu amplitudini de 275 pA, si o constanta de timp de inactivare de 0.81 ms.

 

 

Fig.10G Fitarea constantei de timp de inactivare pentru un curent de potasiu voltaj-dependent spre exterior.

 

 

Referinţe bibliografice

1.Ciontea SM, Radu E, Regalia T, Ceafalan L, Cretoiu D, Gherghiceanu M, Braga RI, Malincenco M, Zagrean L, Hinescu ME, Popescu LM. C-kit immunopositive interstitial cells (Cajal-type) in human myometrium.J Cell Mol Med. 2005 Apr-Jun;9(2):407-20

2.Popescu LM, Faussone-Pellegrini MS.TELOCYTES - a case of serendipity: the winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. J Cell Mol Med. 2010 Apr;14(4):729-40. 

3.Popescu LM, Hinescu ME, Ionescu N, Ciontea SM, Cretoiu D, Ardelean C. Interstitial cells of Cajal in pancreas. J Cell Mol Med. 2005 Jan-Mar;9(1):169-90.

4.Popescu LM, Ciontea SM, Cretoiu D, Hinescu ME, Radu E, Ionescu N, Ceausu M, Gherghiceanu M, Braga RI, Vasilescu F, Zagrean L, Ardeleanu C. Novel type of interstitial cell (Cajal-like) in human fallopian tube. J Cell Mol Med. 2005 Apr-Jun;9(2):479-523. 

5.Gherghiceanu M, Popescu LM.Interstitial Cajal-like cells (ICLC) in human resting mammary gland stroma. Transmission electron microscope (TEM) identification.J Cell Mol Med. 2005 Oct-Dec;9(4):893-910.

6.Hinescu ME, Gherghiceanu M, Mandache E, Ciontea SM, Popescu LM. Interstitial Cajal-like cells (ICLC) in atrial myocardium: ultrastructural and immunohistochemical characterization. J Cell Mol Med. 2006 Jan-Mar;10(1):243-57.

7.Popescu LM, Ciontea SM, Cretoiu D. Interstitial Cajal-like cells in human uterus and fallopian tube. Ann N Y Acad Sci. 2007 Apr;1101:139-65. Epub 2007 Mar 14. Review.

8.Hinescu ME, Popescu LM, Gherghiceanu M, Faussone-Pellegrini MS.Interstitial Cajal-like cells in rat mesentery: an ultrastructural and immunohistochemical approach. J Cell Mol Med. 2008 Jan-Feb;12(1):260-70. Epub 2007 Jan 9.

9.Gherghiceanu M, Hinescu ME, Andrei F, Mandache E, Macarie CE, Faussone-Pellegrini MS, Popescu LM.Interstitial Cajal-like cells (ICLC) in myocardial sleeves of human pulmonary veins. J Cell Mol Med. 2008 Sep-Oct;12(5A):1777-81. Epub 2008 Jul 30.

10.Popescu LM, Manole CG, Gherghiceanu M, Ardelean A, Nicolescu MI, Hinescu ME, Kostin S. Telocytes in human epicardium. J Cell Mol Med. 2010 Aug;14(8):2085-93. doi: 10.1111/j.1582-4934.2010.01129.x..

11.Suciu L, Popescu LM, Gherghiceanu M, Regalia T, Nicolescu MI, Hinescu ME, Faussone-Pellegrini MS. Telocytes in human term placenta: morphology and phenotype. Cells Tissues Organs. 2010;192(5):325-39. 

12.Hinescu ME, Gherghiceanu M, Suciu L, Popescu LM. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy. Cell Tissue Res. 2011 Feb;343(2):389-97.

13.Popescu LM, Vidulescu C, Curici A, Caravia L, Simionescu AA, Ciontea SM, Simion S. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine.Eur J Pharmacol. 2006 Sep 28;546(1-3):177-81.

14.Bassingthwaighte J, Hunter P, Noble D. The cardiac physiome; perspectives for the future. Exp Physiol. 2009;94(5):597-605.

15.Schotten U, Verheule S, Kirchhof P, Goette A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiol Rev. 2011;91(1):265-325.

16.Shenasa M, Hindricks G, Borggrefe M, Breithardt G. Cardiac Mapping. 3rd ed. Wiley-Blackwell; 2009.

17.Lammers WJEP, Ver Donck L, Stephen B, Smets D, Schuurkes JAJ. Origin and propagation of the slow wave in the canine stomach: outline of the gastric conduction system. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009;296(6):G1200-G1210.

18.O’Grady G, Du P, Cheng LK, et al. The origin and propagation of human gastric slow wave activity defined by high resolution mapping. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;299(3):G585-G592.

19.Lammers WJEP, Ver Donck L, Stephen B, Smets D, Schuurkes JAJ. Focal activities and re-entrant propagations as mechanisms of gastric tachyarrhythmias. Gastroenterology. 2008;135(5): 1601-1611.

20.Lammers WJ, Stephen BS, Karam SM. Functional reentry and circus movement arrhythmia in the small intestine of the normal and diabetic rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012; 302(7):G684-G689.

21.Bozler E. Physiological evidence for the syncytial character of smooth muscle. Science. 1937;86(2238):476.

22.Csapo AI. Smooth muscle as a contractile unit. Physiol Rev. 1962; 42(suppl 5):7-33.

23.Kao CY. Long-term observations of spontaneous electrical activity of the uterine smooth muscle. Am J Physiol. 1959;196(2): 343-350.

24.Merkatz IR. Preface. Am J Perinatol. 1989;6(2):103-104.

25.Marshall JM. Regulation of activity in uterine smooth muscle. Physiol Rev. 1962;42(5):213-227.

26.Marshall JM. Effects of oestrogen and progesterone on single uterine muscle fibres in the rat. Am J Physiol. 1959;197:935-942.

27.Anderson NC. Physiological basis of myometrial function. Semin Perinatol. 1978;2(3):211-222.

28.Fuchs AR, Poblete VJ. Oxytocin and uterine function in pregnant and parturient rats. Biol Reprod. 1970;2(3):387-400.

29.Lodge S, Sproat JE. Resting membrane potentials of pacemaker and non pacemaker areas in rat uterus. Life Sci. 1981;28(20):2251-2256.

30.Parkington HC, Harding R, Sigger JN. Co-ordination of electrical activity in the myometrium of pregnant ewes. J Reprod Fert. 1988;82(2):697-705.

31.Caldeyro-Barcia R, Alvarez H, Reynolds SRM. A better understanding of uterine contractility through simultaneous recording with an internal and seven channel external method. Surg Gynecol Obstet. 1950;91(6):641-650.

32.Fuchs AR. Uterine activity in late pregnancy and during parturition in the rat. Biol Reprod 1969;1(4):344-353.

33.Crane LH, Martin L. In vivo myometrial activity during early pregnancy and pseudo-pregnancy in the rat. Reprod Fertil Dev.1991;3(3):233-244.

34.Wolfs G, Rottinghuis H. Electrical and mechanical activity of the human uterus during labour. Arch Gynak. 1970;208(4): 373-385.

35.Wolfs G, van Leeuwen M, Rottinghuis H, Boeles JThF. An electromyographic study of the human uterus during labor. Obstet Gynecol. 1971;37(2):241-246.

36.Miller SM, Garfield RE, Daniel EE. Improved propagation in myometrium associated with gap junctions during parturition. Am J Physiol. 1989;256(1 Pt 1):C130-C141.

37.Huizinga JD, Thuneberg L, Kluppel M, Malysz J, Mikkelsen HB, Bernstein A. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 1995;373(6512):347-349.

38.Lammers WJEP, Arafat K, El-Kays A, El-Sharkawy TY. Spatial and temporal variations in local spike propagation in the myometrium of the 17-day pregnant rat. Am J Physiol. 1994;267(5 Pt 1):C1210-C1223.

39.Eswaran H, Govindan RB, Furdea A, Murphy P, Lowery CL, Preissl HT. Extraction, quantification and characterization of uterine magnetomyographic activity—a proof of concept case study. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2009;144(suppl 1):S96-S100.

40.Rabotti C, Mischi M, Oei SG, Bergmans JW. Noninvasive estimation of the electrohysterographic action-potential conduction velocity. IEEE Trans Biomed Eng. 2010;57(9):2178-2187.

41.Hille B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition, Sinauer Associates Inc., 2001.

42.Petruska JC, Napaporn J, Johnson RD, Gu JG, Cooper BY. Subclassified acutely dissociated cells of rat DRG: histochemistry and patterns of capsaicin-, proton-, and ATP-activated currents. J Neurophysiol. 2000;84(5):2365-79.

 

 

Rezultate Etapa II/2013

 

Rezumatul etapei

Mecanismele fiziologice ale miometrului uman prin care se mentine starea de liniste contractila din timpul gestatiei, precum si cele implicate in declansarea travaliului sunt inca necunoscute complet. Recent, telocitele au fost descrise ca noi elemente celulare ale spatiului interstitial. Acestea ar putea influenta, prin intermediul prelungirilor lor denumite telopode, activitatea contractila a celulelor musculare netede din miometrul uman. Pentru a putea descifra mecanismele care stau la baza excitabilitatii uterine, am incercat sa evaluam prezenta si caracteristicile functionale ale canalelor de calciu de tip T la nivelul telocitelor din uterul negravid si gravid. Am utilizat in acest scop metode de imunofluorescenta si electrofiziologie aplicate culturilor celulare obtinute din miometru, in cele doua stari fiziologice. De asemenea, s-au realizat experimente de stimulare locala cu pensata optica a telopodelor, atat in cazul telocitelor din miometrul ne-gravid cat si gravid.

Au fost evidentiate diferente semnificative in viteza de crestere ghidata a telopodelor. S-a realizat caracterizarea curentilor de Ca2+ de tip L exprimati in telocitele din miometrul uman. Numai telocitele aflate in contact direct (cuplaj electric) cu miocitele invecinate prezinta acesti curenti.

 

REZULTATE

Rezultatele etapei actuale sunt corespunzătoare cu obiectivele propuse.

 

 

 

Rezultate Etapa III/2014

 

Rezumatul etapei

 

Mecanismele fiziologice ale miometrului uman prin care se mentine starea de liniste contractila din timpul gestatiei, precum si cele implicate in declansarea travaliului sunt inca necunoscute complet. Recent, telocitele au fost descrise ca noi elemente celulare ale spatiului interstitial. Acestea ar putea influenta, prin intermediul prelungirilor lor denumite telopode, activitatea contractila a celulelor musculare netede din miometrul uman. Pentru a putea descifra mecanismele care stau la baza excitabilitatii uterine, am incercat sa evaluam prezenta si caracteristicile functionale ale canalelor de calciu de tip T la nivelul telocitelor din uterul negravid si gravid. Am utilizat in acest scop metode de imunofluorescenta si electrofiziologie aplicate culturilor celulare obtinute din miometru, in cele doua stari fiziologice. De asemenea, s-au realizat experimente de stimulare locala cu pensata optica a telopodelor, atat in cazul telocitelor din miometrul ne-gravid cat si gravid.

 

Au fost evidentiate diferente semnificative in viteza de crestere ghidata a telopodelor. S-a realizat caracterizarea curentilor de Ca2+ de tip L exprimati in telocitele din miometrul uman. Numai telocitele aflate in contact direct (cuplaj electric) cu miocitele invecinate prezinta acesti curenti.

 

 

REZULTATE

 

Rezultatele etapei actuale sunt corespunzătoare cu obiectivele propuse.